¿Cuál es el método oficial para la determinación de nitrógeno proteico en alimentos?

En un principio, el químico danés Johan Kjeldahl desarrolló un método de análisis químico para determinar la cantidad de nitrógeno en ciertos compuestos orgánicos, que se denominó método Kjeldahl en su honor. Hasta el momento, ha sido el análisis químico oficial para medir el contenido de nitrógeno en la leche. Se trata de un método volumétrico, basado en la conversión del nitrógeno presente en la muestra a sales de amonio, las cuales son valoradas posteriormente por volumetría ácido-base. Consta de tres etapas: digestión de la muestra, destilación con arrastre de vapor del amoniaco producido y su posterior valoración ácido-base.

Digestión de la muestra: el hidrógeno y el oxígeno proteico son oxidados hasta dióxido de carbono y agua, mientras que el nitrógeno es convertido en sulfato de amonio por la acción de un agente oxidante en medio ácido y con la ayuda de un catalizador. Se han desarrollado diferentes variantes en las cuales cambia el catalizador o el agente oxidante, pero en todos los casos el objetivo final de esta etapa es convertir el nitrógeno proteico en sulfato de amonio.


Proteína (s) + H2SO4 (ac) + Catalizador(s) -> CO2 (g) + H2O (g) + NH4SO4 (ac)
Destilación: mediante la acción de una base fuerte (generalmente NaOH al 40%) se libera el amoníaco de la sal de amonio, el cual se arrastra con vapor y se recoge sobre un volumen exactamente medido de un ácido estándar.



NH4HSO4 (ac) + 2 NaOH -> NH3 (g) + Na2SO4 (ac) + H2O(g)

NH3 (g) + H2O (g) ->
NH4OH (ac)


Valoración ácido-base: la titulación se hace con una base valorada y en presencia de un indicador adecuado, de tal manera que se de termina el ácido que no reaccionó con el hidróxido de amonio destilado, y por diferencia, se calcula el hidróxido de amonio producido.

Para el caso específico de la leche, se determina el nitrógeno total existente mediante la aplicación de este método. De forma general, una determinada cantidad pesada de leche se trata con ácido sulfúrico en presencia de óxido de mercurio (II) como catalizador, con objeto de transformar el nitrógeno de los compuestos orgánicos en nitrógeno amoniacal. El amoniaco se libera por adición de NaOH, se destila y se recoge en una solución de ácido bórico. Por último, el amoniaco es valorado.



Procedimiento seguido para el análisis en la leche (BOE
)

Preparación de la muestra: Antes del análisis es necesario poner la muestra a 20º +/- 2ºC y mezclarla cuidadosamente, con el objetivo de obtener una dispersión homogénea de la materia grasa. Si esto no fuera posible, debe calentarse a 40ºC, se mezcla suavemente y se enfría de nuevo a 20º +/- 2ºC.

Determinación: Se introduce sucesivamente en el matraz Kjeldahl algunas perlas de vidrio o pequeños trozos de porcelana, 10 gramos de Sulfato de potasio, 0,5 gramos de Óxido de Mercurio II rojo y alrededor de 5 gramos de leche exactamente pesados (con aproximación de 1mg).


A continuación se añaden 20 ml de Ácido Sulfúrico 96% y se mezcla el contenido del matraz. Debe calentarse cuidadosamente el matraz Kjeldahl sobre el dispositivo para la reacción hasta que no se forme espuma y el contenido se vuelva líquido. En este momento el calentamiento debe continuar de forma más intensa, con agitación de vez en cuando, hasta que el líquido esté perfectamente limpio e incoloro, llevándolo a ebullición posteriormente durante una hora y media, evitando sobrecalentamientos locales.

Transcurrido este tiempo debe enfriarse el contenido del matraz a temperatura ambiente y deben añadirse 150 ml de agua y algunos fragmentos de piedra pómez ( se mezcla cuidadosamente y se deja enfriar algo más). LLegados a este punto se adicionan 50 ml de Ácido Bórico solución 4% RE en el matraz erlenmeyer, cuatro gotas de indicador, y se mezcla. Situar el matraz erlenmeyer bajo el refrigerante de modo que el extremo del tubo de salida se introduzca en la solución de Ácido Bórico. A continuación se añaden 80ml de Hidróxido de Sodio que contenga sulfuro al contenido del matraz Kjeldahl manteniendo el matraz inclinado, de tal modo que el Hidróxido de Sodio se deslice a lo largo de la pared del recipiente y que los líquidos no se mezclen. Inmediatamente debe conectarse el matraz Kjeldahl al refrigerante por medio de una alargadera y se mezcla el contenido del matraz por agitación, calentando a ebullición evitando la espuma. Se prosigue la destilación hasta el momento en que el contenido del matraz presente ebullición a saltos. El calentamiento debe regularse de modo que la destilación dure por lo menos 20 minutos.

El destilado debe enfriarse bien para evitar que se caliente la solución de Ácido Bórico. Poco tiempo antes de terminar la destilación debe bajarse el matraz erlenmeyer para que el tubo de salida no esté introducido en la disolución de Ácido Bórico. Se detiene el calentamiento, se eleva el tubo de salida y se enjuaga sus paredes exteriores e interiores con un poco de Agua (PA-ACS). El destilado debe valorarse con Ácido Clorhídrico 0,1 M (0,1N).


Esquema del montaje de una digestión mediante Kjeldahl:
kjeldahl2.gif
Ensayo en blanco: Se efectúa un ensayo en blanco aplicando el método que se ha descrito, pero utilizando 5 ml de Agua (PA-ACS) en lugar de leche.

Cálculo: se calcula el contenido de nitrógeno total mediante la fórmula:

Nitrógeno total %= [ 1,40N (V1-V0)] / P
  • N= normalidad del ácido clorhídrico
  • V1= volumen en ml de ácido clorhídrico
  • V0= volumen en ml de ácido clorhídrico utilizado en el ensayo en blanco
  • P= peso en gramos de la leche empleada en el análisis

La diferencia máxima entre dos determinaciones no debe sobrepasar el 0,005% de nitrógeno.


Referencia: (Norma Internacional FIL-IDF 20:1962)

En el Real Decreto 1679/1994, capítulo I, artículo 5,apartado 9, publicado en BOE, nº229, de fecha 24/9/94, se indica que la leche de vaca contiene un mínimo de 28 gramos de materia proteica por litro, obtenida al multiplicar el contenido de nitrógeno total de la leche expresado porcentualmente por 6,38 (factor de conversión).

Sistema Kjeldahl de digestión moderno:

Sistema_Kjeldahl_moderno.jpg